Activity Signaling 神經元檢測工具-NPAS4 抗體一級代理

發布者：北京博蕾德生物發布時間：2024-11-01 分享到：

神經元PAS結構域蛋白4（Npas4），也稱為Le PAS、NXF、PASD10、bHLHe79，是PER ARNT SIM（bHLH PAS）類轉錄調節因子中的一員。Npas4由神經元特異性即刻早期基因（IEG）Npas4編碼，該基因受到神經元活動的強烈誘導。與cfos等傳統IEG不同，npas4對cAMP或神經營養因子等旁分泌因子的刺激沒有反應（Lin等人，2008）。此外，Npas4表達比其他IEG更快速、更短暫（Ramamoorthi等人，2011）。這種對神經元活動的緊密調節使Npas4成為大腦中神經元活動的理想標志物。Activity Signaling 為神經學研究供應重組Npas4單抗，用于神經元檢測研究。

NPAS4 背景簡介：

神經元活性參與信號通路，產生基因表達的改變，導致神經元的長期適應性變化，這種變化是行為可塑性的基礎。自從30多年前發現去極化作用可以驅動C-Fos基因的轉錄以來，關于興奮-轉錄偶聯機制有大量研究。突觸傳遞過程中通過NMDA受體進入的Ca²⁺離子和隨后去極化的L型電壓依賴性鈣通道充當第二信使，參與各種信號轉導途徑，激活轉錄因子以驅動早期基因的轉錄。
Fos、arc和egr1（zif268）等傳統IEG已被用作環境刺激驅動的神經元活動的替代標記，通過原位雜交、免疫染色或轉基因動物等技術鑒定最近活躍的神經元。這些神經元的功能重要性在最近的研究中得到了證明，這些研究利用fos的活性依賴性，在恐懼條件反射期間激活的神經元群中表達基因編碼的光遺傳工具或設計藥物受體。隨后對這些神經元群的人工激活足以模擬恐懼反應。
雖然傳統的IEG在識別活動依賴性回路方面發揮了重要作用，但這些基因的表達可能并不完全適應神經元活動。傳統的IEG轉錄是對突觸活動和Ca2+進入的反應，也是對生長因子信號、神經營養因子和神經調節劑通過cAMP信號的反應。

相比之下，Michael Greenberg的實驗室表明，神經元特異性IEG npas4是由神經元活動強烈而迅速誘導的，但對旁分泌因子沒有反應。這種對神經元活動的緊密調節表明，Npas4可以成為神經元活動的更特異的標志物。
為了尋找更多對npas4等活性進行純調節的基因，我們對原代培養的小鼠皮質神經元進行了RNA-Seq實驗，并比較了突觸活性或cAMP驅動的表達。

傳統的IEGs被突觸活性和cAMP上調。正如預期的那樣，npas4被突觸活性上調。事實上，在檢測到的所有約15000個轉錄本中，npas4基因是誘導活性最高的，但正如Greenberg實驗室所預測的那樣，cAMP不會上調npas4。重要的是，沒有發現任何其他對神經元活動表現出類似調節的基因。
為了研究體內npas4的誘導，我們進行了情境恐懼條件反射（cFC）實驗，并用qPCR和RNA-Seq測量了海馬和脾后皮質（RSC）中的基因表達，這兩個腦區已知與學習和記憶有關。在這些實驗中，動物沒有習慣于恐懼條件反射箱，相對于小鼠居住籠的反應代表了對編碼模塊，而不是恐懼記憶本身。訓練后對fos、arc和npas4誘導的時間過程的檢查表明，兩個腦區的npas4 mRNA水平在1小時內恢復到基線水平，而fos和arc表達在較長時間內保持升高。
為了研究體內npas4的誘導，我們進行了情境恐懼條件反射（cFC）實驗，并用qPCR和RNA-Seq測量了海馬和脾后皮質（RSC）中的基因表達，這兩個腦區已知與學習和記憶有關。在這些實驗中，動物沒有習慣于恐懼條件反射箱，相對于小鼠居住籠的反應代表了對編碼模塊，而不是恐懼記憶本身。訓練后對fos、arc和npas4誘導的時間過程的檢查表明，兩個腦區的npas4 mRNA水平在1小時內恢復到基線水平，而fos和arc表達在較長時間內保持升高。

這與Yingxi Lin實驗室的數據一致，該數據顯示，在cFC訓練后，這三個基因的結果相似。此外，他們發現神經元中的急性npas4敲除阻止了fos、arc和zif268/egr1的誘導，這表明npas4是活性依賴性基因誘導的主要調節因子。
為了證明脾后皮質中的IEG誘導是由cFC期間NMDA受體的激活誘導的，我們進行了實驗，將小鼠暴露于NMDAR拮抗劑MK-801或賦形劑對照溶液中。重要的是，盡管進行了大量的預處理，但傳統的IEG如arc、fos和egr1在注射后仍增加了表達，這可能是由于經驗導致的。

Figure 4: Npas4 does not respond to the stress of vehicle injection.
有趣的是，載體注射后npas4沒有增加。所有IEG，包括對cFC的反應，都增加了它們的表達。用MK-801阻斷NMDAR可以部分阻止傳統IEG表達的增加，而npas4的增加完全取決于NMDAR的激活。綜上所述，這些數據表明npas4對載體注射激活的途徑沒有反應。相反，npas4對cFC有選擇性反應，并提供更高保真的突觸活動讀數。
上述數據充分表明，傳統IEG對神經元活動本身以外的信號有反應。另一個類似的發現來自對晝夜節律周期中IEG調節的研究。有趣的是，發現海馬體中傳統IEGs fos和arc的表達水平具有晝夜節律，在光暗周期內一致波動，而npas4轉錄水平保持相對恒定。

這些數據進一步支持了除對環境線索的急性神經元活動反應之外的因素控制傳統IEG表達水平的觀點。
最后，鑒于npas4相對于fos和其他傳統IEG的獨特調節，以及c-fos非常普遍用于標記被認為是“記憶痕跡”或“印跡”的活動依賴性神經元集合的事實，我們想確定npas4和fos是否標記了相同的神經元群。為此，我們進行了RNAScope原位雜交實驗，觀察cFC后的兩個轉錄本。在海馬體的齒狀回區域，發現了一個明顯重疊的最近激活的神經元群。

然而，在CA1區，我們看到不同神經元群體的跡象可能用兩種不同的基因標記。這些數據是初步的，不能用于得出明確的結論，但它們確實明確提出了僅依靠c-Fos來識別最近激活的神經元系綜的問題，尤其是最近將c-Fos表達等同于“印跡細胞”的趨勢。
NPAS4 抗體驗證：

圖1.去極化誘導Npas4在原代神經元培養物中的表達。8次DIV后，通過用TTX阻斷動作電位或用KCl輕度去極化45分鐘來沉默原代培養的胚胎小鼠皮質神經元。輕度去極化利用Ca2+介導的信號機制誘導Npas4轉錄和蛋白質表達。神經元細胞體和樹突用Sigma的抗Map2-Ab（HM-2）標記，Npas4用活性信號Npas4-Ab標記。

圖2.分離小鼠海馬培養物中的抗體驗證。神經元網絡的活動是通過阻斷GABAA受體拮抗劑Bicuulline的抑制性突觸傳遞來驅動的。A）正如預期的那樣，在未刺激的培養物中，抗Npas4-Ab沒有出現免疫反應性，而在驅動興奮性突觸活動后，可以看到強烈的信號。B）在未刺激的對照培養物中，不存在Npas4免疫反應性，然而，AAV感染后小鼠Npas4的過表達導致Npas4條帶突出。
產品訂購：
神經元PAS結構域蛋白4（Npas4），也稱為Le PAS、NXF、PASD10、bHLHe79，是PER ARNT SIM（bHLH PAS）類轉錄調節因子中的一員。Npas4由神經元特異性即刻早期基因（IEG）Npas4編碼，該基因受到神經元活動的強烈誘導。與cfos等傳統IEG不同，npas4對cAMP或神經營養因子等旁分泌因子的刺激沒有反應（Lin等人，2008）。此外，Npas4表達比其他IEG更快速、更短暫（Ramamoorthi等人，2011）。這種對神經元活動的緊密調節使Npas4成為大腦中神經元活動的理想標志物。

品牌	Activity Signaling
產品名稱	Recombinant anti Npas4 Rabbit Mab
貨號	AS-AB18A-100/AS-AB18A-300
規格	100ul/300ul
靈敏度/特異性	通過原代神經元的免疫細胞化學、腦切片的免疫組織化學和蛋白質印跡評估，這種抗Npas4抗體具有最小的非特異性背景結合。此外，npas4-KO小鼠的免疫反應性完全喪失。小鼠睪丸的免疫反應性已經得到證實。未在其他物種中進行測試。
抗體濃度	1mg/ml (無菌PBS),100ul
產品應用	建議神經元染色，免疫組化、Western Blot工作濃度起始濃度1:500-1:2000。最佳稀釋比根據實驗具體優化確定。
產品保存	冰塊運輸，短期4℃保存，長期-20℃分裝凍存。